AAT Bioquest:低豐度靶標(biāo)染色神器----TSA和PSA

今天，要給大家介紹一種用于細(xì)胞和組織中低豐度靶標(biāo)的高分辨率成像技術(shù)。TSA/PSA是一種成熟的細(xì)胞信號(hào)放大技術(shù)，當(dāng)TSA/PSA與我們光穩(wěn)定性、水溶性的iFluor染料結(jié)合后，產(chǎn)生的熒光信號(hào)具有比傳統(tǒng)組織化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和熒光方法產(chǎn)生的信號(hào)更高的檢測(cè)靈敏度。PSA是美國AAT Bioquest自主研發(fā)的與TSA功能類似的信號(hào)放大方法，其熒光信號(hào)強(qiáng)度比廣泛使用的tyramide（TSA）試劑高10-50倍。

TSA/PSA原理

酪胺信號(hào)放大（TSA）是一種基于辣根過氧化酶（HRP）的催化活性對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法。原理為酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)（已標(biāo)記熒光的酪胺在HRP催化H?O?下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)）產(chǎn)生的大量酶促產(chǎn)物與目標(biāo)蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，從而使目標(biāo)蛋白標(biāo)記上特異的熒光或生物素。

圖1.TSA/PSA原理及工作流程圖。相比較于傳統(tǒng)ICC和IHC方法的工作流程，TSA/PSA試劑可以通過較簡(jiǎn)單的步驟實(shí)現(xiàn)對(duì)所需目標(biāo)的靈敏檢測(cè)。

表1.TSA/PSA技術(shù)與傳統(tǒng)熒光對(duì)比

TSA/PSA特點(diǎn)

TSA特點(diǎn)

1.適用廣，多色標(biāo)記

2.多重標(biāo)記可避免抗體種屬交叉問題

3.染色特異性好，信號(hào)強(qiáng)度高，適合低豐度靶標(biāo)

4.石蠟切片樣本熒光染色背景干凈

PSA特點(diǎn)

1.檢測(cè)靈敏度提高了100多倍，比標(biāo)準(zhǔn)IHC，ICC，IF方法高出100倍

2.改進(jìn)的熒光信號(hào)比酪胺（TSA）試劑高10至50倍

3.PSA 自由基的更高反應(yīng)性允許在HRP-靶相互作用位點(diǎn)更快速，有效和更穩(wěn)定記Styramide綴合物。

4.在不降低靈敏度的情況下，PSA可以使用更少量的抗體/探針

TSA/PSA部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

圖2.分別用iFluor 488 PSA和Alexa Fluor 488 TSA染色甲醛固定的石蠟包埋人肺腺癌陽性組織的染色結(jié)果圖。人肺腺癌陽性組織切片用兔抗EpCam抗體染色，然后用polyHRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育，后使用iFluor 488 PSA （Cat#45020）和Alexa Fluor 488 TSA分別染色。圖像顯示iFluor 488 PSA與Alexa Fluor 488 TSA相比提高了熒光IHC的靈敏度。

圖3.分別用iFluor 488 酪胺和Alexa Fluor 488 酪胺染色甲醛固定的石蠟包埋人肺腺癌陽性組織的染色結(jié)果圖。人肺腺癌陽性組織切片用兔抗EpCam抗體染色，然后用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育。顯影：iFluor 488 酪胺（左）；Alexa Fluor 488 酪胺（右）。核染色：DAPI

圖4.Styramide 超級(jí)信號(hào)放大試劑盒的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比。 （A）將HeLa細(xì)胞固定，透化并用各種濃度的兔抗微管蛋白一抗標(biāo)記，建議的稀釋濃度為：1：500。 然后將細(xì)胞直接與AlexaFluor488綴合的山羊抗兔IgG二抗染色，后分別與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、AlexaFluor 488酪胺和iFluor 488 Styramide（#45205）染色。 使用FITC濾光片組拍攝熒光圖像，并以相同的曝光時(shí)間進(jìn)行分析。 （B）測(cè)量相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度，并比較不同檢測(cè)方法之間的強(qiáng)度。

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