Western 免Y印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)。在WB 實(shí)驗(yàn)中常會(huì)出現(xiàn)各種問題，而拖慢實(shí)驗(yàn)速度，使實(shí)驗(yàn)達(dá)不到理想的效果。今天百螢跟各位同學(xué)一起分享下 WB 實(shí)驗(yàn)中各種問題及問題建議。
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常見問題
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可能原因
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建議
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電泳條帶成笑臉狀
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膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統(tǒng)溫度偏高
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減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳
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電泳條帶成皺眉狀
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可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全
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調(diào)整裝置
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拖尾
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樣品溶解不好
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樣品充分溶解混勻后上樣
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紋理(縱向條紋)
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樣品中含有不溶性顆粒
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樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/span>
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條帶偏斜
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電極不平衡或者加樣位置偏斜
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調(diào)整電極和加樣
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條帶兩邊擴(kuò)散
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加樣量過多
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適當(dāng)減少上樣量
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Marker 變黑色
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抗體和 Marker 蛋白反應(yīng)
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在 Marker 和 sample 之間空出一個(gè)孔不上樣
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背景高
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膜封閉不夠
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延長封閉時(shí)間，選擇適宜的抗體稀釋度
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一抗稀釋度不適宜
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對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇適宜的抗體稀釋度
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一抗孵育的溫度偏高
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建議 4℃ 結(jié)合過夜
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二抗?jié)舛榷冗^高
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降低二抗?jié)舛?/span>
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二抗的非特異性背景
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增加一個(gè)二抗對(duì)照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈）
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二抗孵育時(shí)間過久
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減少二抗孵育時(shí)間
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選擇膜的問題
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硝酸纖維素的背景會(huì)比 PVDF 膜低
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膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過
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實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤
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檢測(cè)時(shí)曝光時(shí)間過長
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注意曝光時(shí)間的縮短
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洗膜不充分
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增加洗膜的時(shí)間和次數(shù)
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抗體和封閉蛋白有交叉反應(yīng)
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檢測(cè)抗體與封閉蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應(yīng)
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雜帶較多
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目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)，乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶
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查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小
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目的蛋白有其他剪切本
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查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性
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樣品處理過程中目的蛋白發(fā)生降解
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裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進(jìn)行
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上樣量過高，太敏感
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適當(dāng)減少上樣量
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一抗不純
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純化抗體
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一抗特異性不高
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重新選擇或制備高特異性的抗體
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二抗的非特異性結(jié)合
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增加一個(gè)二抗對(duì)照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈）
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一抗或二抗?jié)舛绕?/span>
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降低抗體濃度
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細(xì)胞傳代較多，導(dǎo)致蛋白變異
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使用原代或傳代少的細(xì)胞作對(duì)照
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蛋白條帶位置
（大?。┎粚?duì)
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二聚體或多聚體存在
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增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度
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翻譯后剪切
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比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執(zhí)行功能時(shí)需要進(jìn)行剪切成活化的形式
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相對(duì)電荷
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氨基酸電荷的組成
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蛋白修飾
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比如糖基化、磷酸化等修飾狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致蛋白分子量增加
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膠濃度
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不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差
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無蛋白條帶
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抗體孵育不充分
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增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間
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酶失活
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直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物
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標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
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設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?？煽紤]增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因
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試劑之間不匹配
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一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性
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一抗失效
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選擇在有效期內(nèi)抗體，幷選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液
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HRP 抑制劑
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所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉
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抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白
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購買抗體前應(yīng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白
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二抗與一抗不匹配
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選擇針對(duì)一抗來源種屬的抗體
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蛋白條帶信號(hào)弱
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抗體孵育不充分
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增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間
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酶活性降低
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直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物
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洗膜過度
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洗膜時(shí)間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20
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標(biāo)本中靶蛋白含量太低
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增加樣本上樣量
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抗體活性降低
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選擇有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置
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蛋白轉(zhuǎn)移不充分
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可以用麗春紅染膜幷結(jié)合染膠（考馬斯藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)移到膜上或轉(zhuǎn)移過度，適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流
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封閉過度
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減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類型
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曝光時(shí)間過短
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延長曝光時(shí)間
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HRP 抑制劑
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所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉
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背景有黑色斑點(diǎn)
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抗體與封閉試劑反應(yīng)
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使用前過濾封閉試劑
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HRP 偶聯(lián)二抗中有聚集體
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過濾二抗試劑，去除聚集體
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暗背景上白色帶
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HRP 含量過高
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降低酶聯(lián)二抗的濃度
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背景有不均勻的白色斑點(diǎn)
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轉(zhuǎn)膜過程中有氣泡存在
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仔細(xì)檢測(cè)，避免存在氣泡
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抗體分布不均勻
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孵育抗體時(shí)使用搖床
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