LysoBrite 橙色，紅色，深紅色和NIR試劑具有很高的光穩(wěn)定性和優(yōu)異的細(xì)胞保留性，可用于各種研究，包括細(xì)胞粘附，趨化性，多藥耐藥性，細(xì)胞活力，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性。 它們適用于增殖和非增殖細(xì)胞，可用于懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。溶酶體是細(xì)胞器，其含有酸水解酶以分解廢物和細(xì)胞碎片。 溶酶體消化多余的或破舊的細(xì)胞器，食物顆粒和吞噬的病毒。 溶酶體周圍的膜允許消化酶在pH4.5下工作。 與微堿性胞質(zhì)溶膠（pH 7.2）相比，溶酶體的內(nèi)部是酸性的（pH 4.5-4.8）。 溶酶體通過(guò)質(zhì)子泵和氯離子通道從細(xì)胞質(zhì)中泵送質(zhì)子穿過(guò)膜來(lái)維持這種pH差異。LysoBrite 溶酶體熒光探針是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)方案

使用LysoBrite 染料的分析方案

概述

準(zhǔn)備細(xì)胞

添加染料工作溶液

在37°C孵育30分鐘

洗滌細(xì)胞

在熒光顯微鏡下分析

注：該方案僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

操作方法

1.制備溶酶體染色溶液：

1.1解凍 LysoBrite 染料至室溫。

1.2通過(guò)將20μL的500 X LysoBrite 染料稀釋到10 mL Hanks和20 mm Hepes緩沖液或緩沖液（HBSS）中，制備染料工作溶液。

注1：對(duì)于一個(gè)96孔板，20μL的LysoBrite 染料就足夠了。 在<-15℃下等分并儲(chǔ)存未使用的LysoBrite 染料儲(chǔ)備溶液。 保護(hù)它免受光照，避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注2：熒光溶酶體指示劑的濃度根據(jù)具體應(yīng)用而變化。 可以根據(jù)特定細(xì)胞類型和細(xì)胞或組織對(duì)探針的滲透性來(lái)修改染色條件。

2.準(zhǔn)備和染色細(xì)胞：

2.1貼壁細(xì)胞：a.在96孔黑色壁/透明底板（100μL/孔/ 96孔板）中或在裝有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的匯合時(shí)，加入等體積的染料加工溶液（來(lái)自步驟1.2）。 b.將細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。 c.用預(yù)熱（37℃）Hanks和20mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，用HBSS或生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。 d.使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注意：如果細(xì)胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或孵育時(shí)間以使染料積累。

2.2對(duì)于懸浮細(xì)胞：a.將等體積的染料加工溶液（來(lái)自步驟1.2）加入細(xì)胞中。將細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。 b.用預(yù)熱（37℃）Hanks和20mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，用HBSS或生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。 c.使用配備有所需過(guò)濾器組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注1：如果細(xì)胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或培養(yǎng)時(shí)間以使染料積累。

注2：懸浮細(xì)胞可以附著在用BD Cell-Tak®（BD Biosciences）處理過(guò)的蓋玻片上，并作為粘附細(xì)胞染色（見(jiàn)步驟2.1）。