今天百螢給大家系統(tǒng)的介紹一下AAT Bioquest的鈣離子熒光探針。AAT Bioquest研發(fā)的鈣離子探針與其他市售的鈣離子熒光探針的區(qū)別是什么？有什么優(yōu)勢？以及探針的更新及發(fā)展歷程等。感興趣的朋友一起看看吧！
鈣離子指示劑的發(fā)展歷程
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產(chǎn)品名稱
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研發(fā)時間
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研發(fā)公司
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產(chǎn)品特點
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圖示
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Fluo-3
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1987
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Roger Tsien
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**款鈣離子熒光探針
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圖1.各類熒光探針熒光強度對比圖
圖2.鈣離子熒光探針在細胞內(nèi)的工作原理
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Fluo-4
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1996
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ThermoFisher
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比Fluo-3的熒光更亮
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Fluo-8
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2008
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AAT Bioquest
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與Fluo-4相比：
1.擁有更亮的熒光
2.易于細胞加載
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Cal-520
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2014
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AAT Bioquest
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與Fluo-4相比：
1.擁有更長的細胞內(nèi)保留時間
2.更高的信噪比
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Calbryte-520
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2017
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AAT Bioquest
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與其他產(chǎn)品相比：
1.它擁有*亮的熒光
2.它擁有*長的細胞內(nèi)保留時間
3.更高的信噪比
4.更容易加載
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Fluo-8
在Fluo-8的研發(fā)之前，F(xiàn)luo-3、Fluo-4已廣泛用于流式細胞術(shù)和酶標儀（如：FLIPR）上的鈣離子檢測，但是，弱熒光信號和苛刻的染料上樣條件限制了它們在某些細胞分析中的應(yīng)用。而Fluo-8的研發(fā)正好解決了Fluo-3和Fluo-4的這些局限性。
Fluo-3和Fluo-4在細胞應(yīng)用中*重要的性質(zhì)是它們的吸收光譜與氬離子激光源488nm處的激發(fā)兼容，并且響應(yīng)于Ca2+結(jié)合，熒光強度大大增強。我們的Fluo-8 鈣離子檢測試劑保留了這兩個優(yōu)良的特性。Fluo-8試劑的吸收和發(fā)射峰分別為490nm和514nm。在488nm的氬離子激光作用下，它們能得到很好的激發(fā)，其發(fā)射熒光（514nm）隨Ca2+濃度的增加而增加。Fluo-8與Ca2+結(jié)合后熒光強度增加200倍以上。由于刺激后許多細胞內(nèi)Ca2+的增加幅度通常是5-10倍，因此Fluo-8是Fluo-3和Fluo-4的**替代品。Fluo-8的Kd估計為389nm（22°C，pH7.0–7.5），但該值可能受到pH、粘度和體內(nèi)結(jié)合蛋白的影響。
表1.Fluo-8鈣離子檢測試劑的光譜和Ca2+結(jié)合特性
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Ca2+ 熒光探針
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激發(fā)（Ex）
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發(fā)射（Em）
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Ca2+結(jié)合的Kd
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Fluo-8
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490 nm
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514 nm
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389 nM
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Fluo-8H
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490 nm
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514 nm
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232 nM
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Fluo-8L
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490 nm
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514 nm
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1.86 uM
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Fluo-8產(chǎn)品特點：
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方便檢測的波長:*大激發(fā)490 nm；*大發(fā)射514 nm。
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熒光強度高：比Fluo-4 AM高2倍；比Fluo-3 AM高4倍。
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更快的加載:在室溫下（而不是Fluo-4 AM所需的37oC）加載染料。
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多功能Ca2+結(jié)合Kd如表1所示。
圖3.將U2OS細胞以40000細胞/100ul/孔在96孔板中培養(yǎng)過夜。去掉生長培養(yǎng)基，將細胞分別與100ul的Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Fluo-8AM在HHBS中以4 uM的濃度在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。用200ulHHBS洗滌細胞兩次，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。
Fluo-8相關(guān)產(chǎn)品：
Cal-520、Cal-590、Cal-630
Cal-520，Cal-590和Cal-630提供了*強大的基于均相熒光的檢測工具，用于檢測細胞內(nèi)鈣動員。它們是熒光鈣敏感染料，與現(xiàn)有的鈣指示劑（如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有明顯改善的信噪比和細胞內(nèi)滯留性。一旦進入細胞，Cal520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的親脂性基團就會被細胞內(nèi)酯酶裂解，從而產(chǎn)生帶負電荷的熒光染料，并留在細胞內(nèi)部。與鈣離子結(jié)合后，它們的熒光大大增強。當細胞被激動劑刺激時，該受體會發(fā)出細胞內(nèi)鈣釋放的信號，從而增加Cal-520，Cal-590或Cal-630的熒光。 Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的高靈敏度超過100倍的熒光增強特性使其成為測量細胞鈣的理想指標。高信噪比和更好的細胞內(nèi)保留能力使Cal-520，Cal-590或Cal-630鈣測定成為評估GPCR和鈣通道靶標以及篩選其激動劑和拮抗劑的強大工具。
表2.Cal-520，Cal-590或Cal-630 Ca2+檢測試劑的光譜和Ca2+結(jié)合特性
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Ca2+ 熒光探針
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激發(fā)（Ex）
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發(fā)射（Em）
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Kd (nM)
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Cal-520
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492 nm
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514 nm
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320
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Cal-590
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558 nm
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584 nm
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561
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Cal-630
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607 nm
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623 nm
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792
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圖4.不含丙磺舒的CHO-M1細胞中內(nèi)源性P2Y受體對ATP的反應(yīng)。 將CHO-M1細胞以每100 μL 40,000個細胞的孔接種在黑色96孔板中過夜。 將HHBS中的100 μl 4 μM Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM或Cal520 AM加入孔中，并將細胞在37°C下孵育2小時。 將染料加載介質(zhì)替換為100 μl HHBS，添加50 μl 300 μM ATP，然后使用FITC通道在熒光顯微鏡（Olympus IX71）上成像。
圖5.用Cal-520或Fluo-4 AM測量的CHO-K1細胞中內(nèi)源性P2Y受體的ATP刺激鈣反應(yīng)。 將CHO-K1細胞以每100 μL每孔50,000個細胞在黑色96孔板上接種過夜。 將100 μL 5 μM Fluo-4 AM和帶有（A）或不帶有（B）2.5 mM丙磺舒的Cal-520AM加入細胞中，并將細胞在37℃下孵育2小時。 通過FlexStation（分子設(shè)備）添加ATP（50 μL /孔）以達到*終指示的濃度。
圖6.CHO-K細胞中內(nèi)源性P2Y受體對ATP的反應(yīng)。 將CHO-K細胞以每100 μL 40,000個細胞的孔接種在黑色96孔板中過夜。 將含有1 mM丙磺舒的HHBS中的100 μl 4 μM Cal 590 AM或Cal 630 AM加到孔中，并將細胞在37°C下孵育2小時。 將染料上樣介質(zhì)替換為100 μl HHBS和1 mM丙磺舒，然后在添加50 μl 300 μM ATP之前和之后使用TRITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。
Cal-520、Cal-590、Cal-630相關(guān)產(chǎn)品：
Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630
Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630為檢測細胞內(nèi)鈣動員提供了*強大的均相熒光分析工具。與現(xiàn)有的鈣指示劑（例如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，這些對鈣敏感的染料明顯更亮，并提供更高的信噪比，并大大改善了細胞內(nèi)保留和負載效率。一旦進入細胞，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的親脂性阻斷性AM基團就會被細胞內(nèi)酯酶裂解，產(chǎn)生帶負電荷的熒光Calbryte 染料，并留在細胞內(nèi)。與鈣結(jié)合后，它們的熒光大大增強。當細胞受到激動劑刺激時，該受體發(fā)出信號通知細胞內(nèi)鈣的釋放，從而明顯增加Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的熒光。高靈敏度和大于100倍的熒光增強特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是測量細胞內(nèi)鈣的*強指示劑。
表3. Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630試劑的光譜和Ca2+結(jié)合特性。
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Ca2+ 熒光探針
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激發(fā)（Ex）
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發(fā)射（Em）
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Kd (μM)
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Calbryte 520
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492 nm
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514 nm
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1.2
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Calbryte 590
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580 nm
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592 nm
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1.4
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Calbryte 630
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608 nm
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624 nm
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1.2
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圖7. CHO-K1細胞中內(nèi)源性P2Y受體對ATP的反應(yīng)。 將CHO-K1細胞以每100 μL 40,000個細胞的孔接種在黑色96孔板中過夜。 將含有丙磺舒的HHBS中的100 μL Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入孔中，并將細胞在37°C下孵育45分鐘。 將染料加載介質(zhì)替換為200 μL HHBS，添加50 μL 50 μM ATP，并使用FITC通道在熒光顯微鏡（Keyence）上成像。
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圖8.Calbryte 520或Fluo-4 AM測量的CHO-M1細胞中外源M1受體的卡巴膽堿刺激的鈣反應(yīng)。 將CHO-M1細胞以每100 μL每孔40,000個細胞的孔接種在黑色96孔板上。 將100 μL不含丙磺舒的Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入細胞中，并將細胞在37℃下孵育45分鐘。 FlexStation 3（分子設(shè)備）添加了卡巴膽堿（50 μL /孔）以達到*終指示的濃度。
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圖9. CHO-K細胞中內(nèi)源性P2Y受體對ATP的反應(yīng)。 將CHO-K細胞以每100 μL 40,000個細胞的孔接種在黑色96孔板上。 將含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 μL Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM加入孔中，并將細胞在37°C下孵育1小時。 將染料加載介質(zhì)替換為200 μL HHBS，用50 μL 50 μM ATP處理，并使用TRITC通道（Calbryte 590）和Texas Red Channel（Calbryte 630）用熒光顯微鏡（Keyence）成像。
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Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630相關(guān)產(chǎn)品：
單波長與比率法的優(yōu)缺點對比
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單波長
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比率
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1.在靜息鈣水平下背景熒光*小
2.良好的信噪比
3.大大提高了細胞內(nèi)保留
4.覆蓋光譜：紫外線（UV），紫色和可見光激發(fā)
5.不同的親和力（低、中、高）提供的敏感度滿足于各種應(yīng)用
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1.準確測量細胞內(nèi)鈣濃度
2.將染料負載不均勻、染料泄漏、光漂白和細胞厚度變化（常見于混合群體）的影響降至*低
3.提供更可靠和可重復(fù)的結(jié)果
4.指示劑擁有雙激發(fā)/發(fā)射光線
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