細胞凋亡之所以成為人們研究的一個熱點，在很大程度上決定于細胞凋亡與臨床病毒的密切關系。這種關系不僅表現(xiàn)在凋亡及其機制的研究，闡明了一大類**病的發(fā)病機制，而且由此可以導致**新療法的出現(xiàn)。Caspase家族在細胞凋亡中起著至關重要的作用，今天百螢帶你來了解一下Caspase家族與細胞凋亡千絲萬縷的聯(lián)系。
Caspase：
概念：Caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個重要共同點是活性位點都含有半胱氨酸，并特異地斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase一詞是從Cysteine aspartic acid specific protease 的字頭縮寫衍生而來，就反映了這個特征，而這種高度的特異性，在蛋白酶中是很少見的。
機制：半胱天冬酶是細胞質天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，其作為細胞凋亡的主要介質。它們的活化受Bcl-2和IAP蛋白家族成員的調節(jié)。在接收外部或內在死亡信號后刺激活化，這導致細胞內銜接子分子聚集在受體相關細胞溶質復合物上的procaspase。procaspase的聚集通過二聚化或二聚化然后自身蛋白水解切割啟動胱天蛋白酶活化。*初的半胱天冬酶活化導致額外的半胱天冬酶蛋白水解直觀地擴增半胱天冬酶級聯(lián)反應。
細胞凋亡啟動子半胱天冬酶及其各自的分析
根據它們在半胱天冬酶級聯(lián)反應中的作用，半胱天冬酶進一步細分為凋亡啟動子半胱天冬酶和凋亡效應半胱天冬酶。凋亡啟動子半胱天冬酶如胱天蛋白酶-2，-8，-9和-10可以啟動半胱天冬酶激活級聯(lián)反應。例如，胱天蛋白酶-8對于誘導死亡的信號傳導復合物（DISC）的形成是必需的，并且當激活時，半胱天冬酶-8激活下游效應子半胱天冬酶。已證明胱天蛋白酶-8對IETD肽序列顯示出相對高的底物選擇性。百螢生物利用這種酶 - 底物相互作用開發(fā)出有效且穩(wěn)定的試劑盒，用于檢測caspase-8活性。
百螢生物提供三種選擇的Cell Meter?Caspase 8活性細胞凋亡檢測試劑盒，可與不同的過濾器兼容。每個試劑盒含有獨特的熒光指示劑，其由與底物選擇性IETD肽序列綴合的特定熒光發(fā)色團AMC，R110或ProRed TM組成。該測定可以容易地優(yōu)化用于高通量篩選并且量化凋亡細胞中活化的胱天蛋白酶-8的活性或篩選半胱天冬酶8抑制劑。
細胞凋亡效應Caspase及其各自的檢測
細胞凋亡效應caspase如caspase-3，-6和-7可能不是啟動級聯(lián)途徑的原因，但是當它們被激活時，它們在級聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。例如，caspase-3是一種關鍵的效應因子，因為它可以放大來自啟動子半胱天冬酶的信號，并且表示完全致力于細胞分解。使用DEVD肽序列進行活化的胱天蛋白酶-3的檢測，所述DEVD肽序列對胱天蛋白酶-3具有選擇性，并證明在開發(fā)胱天蛋白酶-3底物方面是成功的。百螢生物提供兩套獨特的試劑盒，用于檢測caspase-3/7活性：Amplite?熒光Caspase 3/7檢測試劑盒和Cell Meter?Caspase 3/7活性細胞凋亡試劑盒。
Amplite?熒光Caspase 3/7檢測試劑盒有三種選擇。每個試劑盒都含有一個用熒光發(fā)色團AMC，R110或ProRed?修飾的caspase-3選擇性DEVD肽序列，每個序列都有其獨特的優(yōu)勢?；赯-DEVD-R110的半胱天冬酶底物由于其兩步裂解過程而表現(xiàn)出較窄的動態(tài)范圍。它們比基于香豆素的半胱天冬酶底物更敏感，推薦用于終點分析?；贏MC和AFC的半胱天冬酶底物*適合動力學測定。雖然我們的ProRed?-DEVD基板具有更長的激發(fā)和發(fā)射波長，因此它們對于篩選caspase3 / 7抑制劑非常有用。
Cell Meter?Caspase 3/7活性細胞凋亡試劑盒也有三種選擇，每種都有熒光指示劑底物，用不同的熒光發(fā)色團修飾。這些試劑盒旨在通過測量caspase-3活化來監(jiān)測細胞凋亡。它們耐用性很高、適用范圍很廣，可以很容易地適用于各種熒光平臺（如微孔板分析）中的高通量測定。
信號通路用于細胞凋亡
細胞凋亡傳統(tǒng)上被認為是不可逆的過程，因此細胞凋亡的起始必須通過特定的激活機制嚴格調節(jié)。兩種*廣泛研究和理解的細胞凋亡激活機制是外在和內在途徑。百螢生物的caspase檢測試劑盒已經過優(yōu)化，可檢測和分析半胱天冬酶的活化，因為它們將凋亡信號傳遞到外源或內源途徑。
外在途徑：
負責啟動細胞凋亡的外源凋亡信號傳導途徑使用腫瘤壞死因子（TNF）受體與其相應配體或死亡受體之間的跨膜受體介導的相互作用。TNF受體由富含半胱氨酸的細胞外結構域和80個氨基酸的細胞質結構域組成。死亡受體及其相應配體的二聚化激活受體復合物以開始凋亡信號的透射。在二聚化時，銜接蛋白如FADD的募集引發(fā)胱天蛋白酶原-8募集至死亡誘導信號轉導復合物。procaspase-8寡核苷酸化至死亡誘導信號復合物導致蛋白水解切割和胱天蛋白酶-8活化。（對于外在途徑機制，請參考下面的圖1）
圖1.顯示外在和內在的凋亡信號傳導途徑
半胱天冬酶結合測定在檢測負責啟動細胞凋亡的外在信號傳導途徑中的關鍵事件方面是極好的，例如啟動子和效應子半胱天冬酶的活化。百螢生物提供**的Cell Meter?活細胞半胱天冬酶結合試劑盒系列，使用熒光細胞滲透和無毒指示劑檢測caspase-1，-2，-3 / 7，-6，-8，-9，-10和13活動。在與其適當的半胱天冬酶結合后，熒光試劑保留在細胞內。該結合事件阻止半胱天冬酶的任何進一步催化而不停止細胞凋亡過程。這些半胱天冬酶結合試劑盒適用于熒光顯微鏡，流式細胞儀和熒光微板讀數器。半胱天冬酶測定可以與其他細胞凋亡測定結合進行，以闡明外在和內在凋亡途徑之間的任何關系。例如，使用半胱天冬酶結合測定結合檢測線粒體膜電位變化的測定法可以揭示外在和內在凋亡信號傳導途徑之間的任何潛在的“串擾”。
內在途徑：
內源性凋亡信號傳導途徑由線粒體信號傳導蛋白介導。它的功能是響應各種類型的細胞內刺激，如DNA損傷，生長因子戒斷和死亡受體刺激。接收細胞內刺激激活促凋亡蛋白，例如BH3相互作用結構域死亡激動劑或BID。Bcl-2家族的其他成員，如Bax，與BID蛋白相互作用，允許它們插入線粒體外膜。線粒體膜不穩(wěn)定，允許形成線粒體凋亡誘導的通道，其促進細胞色素c釋放到細胞質中。細胞色素c是促凋亡因子，其與蛋白質凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）相互作用，其募集胱天蛋白酶原-9以形成凋亡體復合物。該復合物的形成裂解并激活凋亡引發(fā)劑caspase-9以啟動半胱天冬酶級聯(lián)反應，*終導致細胞凋亡。（對于外在途徑機制，請參考上面的圖1）
檢測線粒體膜電位（MMP）的變化是內在激活細胞凋亡的重要指標。百螢生物開發(fā)了專有的陽離子線粒體探針，可靈敏地檢測靶細胞線粒體膜電位的任何變化。這些專有探針可作為百螢生物的Cell Meter?MMP檢測試劑盒中的關鍵組分，用于監(jiān)測細胞活力。在正常細胞中，這些線粒體探針發(fā)出紅色熒光，其信號強度與線粒體內積累的探針量成比例。能夠在線粒體內積聚的探針越多，發(fā)出的熒光信號越強烈。然而，在凋亡細胞中，在MMP崩潰后，線粒體染料的熒光強度減弱，表明細胞色素C釋放到細胞質中，從而引發(fā)細胞凋亡的caspase級聯(lián)反應。這些試劑盒已經過單獨優(yōu)化，可用于熒光顯微鏡和熒光和流式細胞儀檢測中的凋亡激活劑和抑制劑的篩選。該試劑盒可與其他試劑結合使用，如Cell Meter?磷脂絲胺酸細胞凋亡檢測試劑盒，用于細胞活力和細胞凋亡的多參數研究。