簡介

iFluor 染料是一系列優(yōu)良的熒光標記染料，可以覆蓋整個可見光譜。所有iFluor 染料都具有優(yōu)異的水溶性。它們的親水性使有機溶劑的使用極小化。 iFluor 染料也具有比經(jīng)典熒光標記染料更好的標記性能，如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7 。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優(yōu)于Alexa Fluor 標記染料。它們是用于標記蛋白質(zhì)和核酸而不包含性能的便宜的熒光染料（替代Alexa Fluor 染料）。每種iFluor染料的開發(fā)都與特定的Alexa Fluor 或其他標記染料（如DyLight 染料）的光譜特性相匹配。

琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的優(yōu)選試劑，因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩(wěn)定。這些試劑通常是穩(wěn)定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時，需要考慮的因素很少：1）。溶劑：在大多數(shù)情況下，活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2）。反應pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。胺反應性試劑與非質(zhì)子化脂族胺基團反應，包括蛋白質(zhì)的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此，胺?；磻ǔＴ?/span>pH 7.5以上進行。通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質(zhì)修飾通?？梢栽?/span>pH 8.5-9.5下進行。 3）。反應緩沖液：使用胺反應試劑時，必須避免使用含有游離胺（如Tris和甘氨酸）和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）也必須在進行染料綴合之前除去（例如通過透析）。 4）。反應溫度：大多數(shù)綴合在室溫下進行。然而，特定標記反應可能需要升高或降低的溫度。

存儲和處理

收到后，iFluor?染料應儲存在<-15 oC，并避免光照和潮濕。 iFluor?染料的重構(gòu)DMSO儲備溶液可以在<-15℃下儲存不到兩周。 蛋白質(zhì)綴合物應在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲存。 當在2mM疊氮化鈉存在下保存并且避光時，綴合物溶液可以在4℃下儲存兩個月而沒有顯著變化。 對于更長時間的儲存，可以將蛋白質(zhì)綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-60℃下儲存，并避光。

染色樣本分析

注意：該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與iFluor?647 SE的綴合物開發(fā)的。 您可能需要進一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。

操作步驟

1.準備蛋白質(zhì)儲備溶液（溶液A）：

將100μL反應緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL給予1 mL蛋白質(zhì)標記原液。

注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質(zhì)應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體不能很好地標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應?？梢酝ㄟ^透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得標記結(jié)果。

注4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率會顯著降低。為獲得**標記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準備染料儲備溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入到iFluor TM染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始綴合前準備染料儲備溶液（溶液B）。 及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環(huán)。

3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標記可能不利地影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續(xù)不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應<10％。

3.2運行綴合反應（參見下面的步驟4）。

3.3重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）（見下頁）。

3.6運行上述4種結(jié)合物的功能測試，確定染料/蛋白質(zhì)比例，以擴大標記反應。

4.運行結(jié)合反應：

4.1有效加入適量的染料儲備溶液（溶液B）到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中晃動。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比。

4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動反應混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實例。

5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的級分。

注1：立即使用時，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥（見下文）。

表征所需的染料 - 蛋白質(zhì)綴合物

取代度（DOS）是表征染料標記蛋白質(zhì)的重要因素。 較低DOS的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強度，但較高DOS（例如DOS> 6）的蛋白質(zhì)也傾向于具有減少的熒光。 根據(jù)染料和蛋白質(zhì)的特性，大多數(shù)抗體的DOS建議在2到10之間。 為了有效標記，應將取代度控制為對于1摩爾抗體具有4-10摩爾的iFluor TM 647 SE。 以下步驟用于確定iFluor TM 647 SE標記蛋白的DOS。

1.測量吸收：

為了測量染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的吸收光譜，建議根據(jù)染料的消光系數(shù)將樣品濃度保持在1-10μM的范圍內(nèi)。

2. 讀取280 nm處的OD（吸光度）和染料吸收（iFluor?647染料的?max= 649 nm）：對于大多數(shù)分光光度計，樣品（來自色譜柱部分）需要用去離子水稀釋，以便OD 值在0.1至0.9的范圍內(nèi)。 O.D. （280nm處的吸光度）是蛋白質(zhì)的極大吸收，而649nm是iFluor TM 647 SE的極大吸收。 為了獲得準確的DOS，確保綴合物不含非共軛染料。

3. 使用以下等式計算DOS：

[染料]是染料濃度，并且可以根據(jù)Bee-Lambert定律容易地計算：A =εdyeCL。 [蛋白質(zhì)]是蛋白質(zhì)濃度。 如果共軛效率足夠高（優(yōu)選> 70％）或通過比爾 - 朗伯定律更準確地計算，則該值可以通過重量（加入反應）估算：A =ε蛋白質(zhì)CL。 例如，IgG的ε值為203,000cm-1M-1。 Pε280= 280nm處的蛋白質(zhì)摩爾消光系數(shù)（例如IgG的摩爾消光系數(shù)為203,000cm-1M-1）。 對于iFluor TM 647染料SE，CF（280nm處的染料吸收校正因子）= OD280 / OD649 = 0.03。 250,000 cm-1M-1是iFluor?647 SE的摩爾消光系數(shù)。

參考文獻

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