物理化學(xué)性質(zhì)
分子量：315.41
溶劑：DMSO
光譜性質(zhì)：激發(fā)= 518nm; 熒光= 605nm
生物應(yīng)用
Hydroethidine可有效地作為測(cè)量活性氧物質(zhì)的探針。 染料自由進(jìn)入細(xì)胞并脫氫成溴化乙錠。該探針已廣泛用于NK細(xì)胞，并作為鑒定腫瘤中增殖和缺氧細(xì)胞的重要染料。已經(jīng)使用嗜中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及HL60細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行了研究。該探針的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠區(qū)分超氧化物和H2O2。 熒光發(fā)射發(fā)生在約600nm處。
染色細(xì)胞的樣本方案
以下過(guò)程提供了一般準(zhǔn)則，應(yīng)根據(jù)您的特定應(yīng)用進(jìn)行修改。
1.制備5-10 mM DMSO儲(chǔ)備溶液。 應(yīng)將未使用的DMSO儲(chǔ)備溶液等分到單次使用的小瓶中并儲(chǔ)存在-20°C，避光。
2.在生理緩沖液（如PBS，HBSS，HEPES）中使染料的工作濃度為5-20μM。 您的應(yīng)用的*佳工作濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。
3.將染料工作溶液（來(lái)自步驟2）的等體積（例如100μL細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中）加入細(xì)胞中，并在室溫或37℃下培養(yǎng)細(xì)胞5至60分鐘。
4.在將細(xì)胞暴露于實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)物之前，確定加載細(xì)胞樣品的基線(xiàn)熒光強(qiáng)度。
5.陰性對(duì)照應(yīng)評(píng)估如下：
5.1檢查有和沒(méi)有誘導(dǎo)物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無(wú)細(xì)胞混合物的熒光。在沒(méi)有細(xì)胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，熒光隨時(shí)間的逐漸增加可能與自發(fā)水解，大氣氧化或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。
5.2檢查已經(jīng)保持在生長(zhǎng)培養(yǎng)基或緩沖液中的未處理（對(duì)照）負(fù)載細(xì)胞的熒光。在健康細(xì)胞中，氧自由基被細(xì)胞酶或天然抗氧化劑消除。在染料加載恢復(fù)期后，健康細(xì)胞應(yīng)表現(xiàn)出低水平的熒光，在實(shí)驗(yàn)期間相對(duì)穩(wěn)定;然而，可以觀察到熒光逐漸增加（由于自動(dòng)氧化）或減少（由于細(xì)胞中的染料損失或光漂白）。在沒(méi)有任何刺激或誘導(dǎo)的情況下，健康的未經(jīng)處理的細(xì)胞中的熒光突發(fā)可以指示細(xì)胞死亡或一些其他氧化事件的進(jìn)展。
6.可以用叔丁基過(guò)氧化氫（TBHP）刺激陽(yáng)性對(duì)照至終濃度~100μM（基于細(xì)胞的敏感性和反應(yīng)增加或減少劑量）。
參考文獻(xiàn)
1. Zielonka J, Sarna T, Roberts JE, Wishart JF, Kalyanaraman B. (2006) Pulse radiolysis and steady-state analyses of the reaction between hydroethidine and superoxide and other oxidants. Arch Biochem Biophys.
2. Burnaugh L, Sabeur K, Ball BA. (2006) Generation of superoxide anion by equine spermatozoa as detected by dihydroethidium. Theriogenology.
3. Fernandes DC, Wosniak J, Pescatore LA, Bertoline MA, Liberman M, Laurindo F, Santos CX. (2006) Analysis of dihydroethidium-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. Am J Physiol Cell Physiol.
4. Zielonka J, Vasquez-Vivar J, Kalyanaraman B. (2006) The confounding effects of light, sonication, and Mn(III)TBAP on quantitation of superoxide using hydroethidine. Free Radic Biol Med, 41, 1050.
5. Zielonka J, Zhao H, Xu Y, Kalyanaraman B. (2005) Mechanistic similarities between oxidation of hydroethidine by Fremy's salt and superoxide: stopped-flow optical and EPR studies. Free Radic Biol Med, 39, 853.